細胞鋪板具體操作及流程

細胞鋪板是細胞實(shí)驗中的基礎操作，其目的是將細胞均勻分布在培養板上，以保證實(shí)驗結果的準確性和可重復性。下面為你介紹詳細操作流程：

1.實(shí)驗準備

材料：細胞懸液、培養基、胰酶、PBS 緩沖液、血清、96 孔板或 24 孔板等培養板。

器材：移液器及配套槍頭、離心機、細胞培養箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡。

試劑配制：提前配制好含 10% 血清的培養基，若細胞貼壁性差，還需用多聚賴(lài)氨酸對培養板進(jìn)行包被處理，即將適量多聚賴(lài)氨酸溶液加入培養板各孔，室溫孵育 1-2 小時(shí)，吸去溶液，用 PBS 沖洗 2-3 次，晾干備用。

2.細胞懸液制備

取出細胞：從培養箱中取出長(cháng)滿(mǎn)細胞的培養瓶，在超凈工作臺內，用移液器吸去瓶?jì)扰f的培養基。

清洗細胞：向瓶?jì)燃尤脒m量 PBS 緩沖液，輕輕晃動(dòng)培養瓶，潤洗細胞 1-2 次，以去除殘留培養基及雜質(zhì)，吸去 PBS。

消化細胞：加入適量胰酶溶液，覆蓋細胞層，將培養瓶置于顯微鏡下觀(guān)察，當細胞開(kāi)始變圓、脫離瓶壁時(shí)，立即加入含血清的培養基終止消化。血清中的蛋白可中和胰酶活性，防止過(guò)度消化。

吹打細胞：用移液器反復輕柔吹打細胞層，使細胞全部分散成單細胞懸液。吹打過(guò)程要控制力度，避免產(chǎn)生過(guò)多氣泡損傷細胞。

離心收集：將細胞懸液轉移至離心管，以 1000-1500 轉 / 分鐘的速度離心 3-5 分鐘，使細胞沉淀在管底。

重懸細胞：吸去上清液，加入適量新鮮培養基，用移液器輕柔吹打，將細胞重懸，制成均勻的細胞懸液。

3.細胞計數

稀釋細胞懸液：取少量細胞懸液，用培養基按 1:1 或 1:2 的比例稀釋?zhuān)苊饧毎麧舛冗^(guò)高難以計數。

加載細胞懸液：將稀釋后的細胞懸液滴加在血細胞計數板的計數區，注意不要產(chǎn)生氣泡，蓋上蓋玻片。

計數細胞：在顯微鏡下，計數計數板四個(gè)大格內的細胞總數。壓線(xiàn)細胞遵循 “計上不計下，計左不計右" 原則，避免重復計數。根據公式計算細胞濃度：細胞濃度（個(gè) /mL）=（四個(gè)大格細胞總數 / 4）× 稀釋倍數 ×10^4 。

4.細胞鋪板

計算鋪板體積：根據實(shí)驗需求和培養板規格，確定每孔所需細胞數量。如 96 孔板每孔一般接種 5×10^3 - 2×10^4 個(gè)細胞，24 孔板每孔接種 5×10^4 - 2×10^5 個(gè)細胞。根據細胞濃度計算所需細胞懸液體積，如細胞濃度為 1×10^5 個(gè) /mL，96 孔板每孔需接種 1×10^4 個(gè)細胞，則每孔需加入細胞懸液體積為 100μL。

鋪板操作：用移液器吸取計算好體積的細胞懸液，加入培養板相應孔中。從培養板一側邊緣開(kāi)始，逐孔加入，避免液體濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣過(guò)程中，若需接種多塊板，應保持移液器操作一致，確保每孔細胞數量均勻。

輕柔混勻：加樣完成后，將培養板在水平桌面上輕輕晃動(dòng)，或使用平板振蕩器，低速振蕩 1-2 分鐘，使細胞在孔內均勻分布。注意振蕩幅度不宜過(guò)大，以免細胞聚集。

5.培養觀(guān)察

放入培養箱：將鋪好細胞的培養板放入 37℃、5% CO?的細胞培養箱中培養。CO?可維持培養基 pH 值穩定。

定期觀(guān)察：培養 2-4 小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞貼壁及分布情況。若發(fā)現細胞分布不均，可輕微調整培養板位置，繼續培養。后續每天定時(shí)觀(guān)察細胞生長(cháng)狀態(tài)，包括細胞形態(tài)、密度等，為后續實(shí)驗做準備。

細胞鋪板過(guò)程需嚴格遵守無(wú)菌操作原則，動(dòng)作輕柔，確保細胞活性及分布均勻性，這樣才能保證實(shí)驗順利進(jìn)行。

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