實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項---FAQ

FAQ

總RNA提取-酚氯仿抽提法

RNA降解

組織樣本保存不當。RNA提取時(shí)需選擇新鮮組織或細胞樣本，若為凍存樣本，盡量避免反復凍融。樣品離開(kāi)活體或原來(lái)的生長(cháng)環(huán)境后，樣品中的內源 RNase開(kāi)始降解 RNA，降解速度與內源 RNase 的含量及溫度有關(guān)。 也可將新鮮組織充分浸泡在 RNA Keeper Tissue Stabilizer (Vazyme #R501) 中，組織可于室溫存放一周，4℃存放一個(gè)月 或 -20℃ /-80℃長(cháng)期保存。 投入樣本較多，導致裂解不充分。RNA保存時(shí)間過(guò)久，發(fā)生降解。對提取的 RNA 進(jìn)行純度和完整度檢測，分管于 -80℃長(cháng)期保存或于 -20℃短期保存，盡快使用，避免反復凍融。

提取的RNA有基因組污染

向裂解液中加入氯仿后，需要在低溫下 (2℃ -8℃ ) 高速離心。 離心后，RNA 被抽提到上層的水相中，中、下層為有機相，含有氯仿。DNA 即存在于中層。氯仿在常溫下會(huì )與水以一定的比例互溶，因此，常溫離心會(huì )導致上層水相中也有少量基因組 DNA 污染。另外，吸取上層液體時(shí)，應非常小心，避免吸到中間層和下層。

加入異丙醇離心后未看到沉淀

RNA 含量可能較低。建議加入異丙醇后于 4℃或 -20℃放置 10-30 min 后再次離心。若依然看不到沉淀，棄上清時(shí)，采用吸取而非傾倒的方法，以免沉淀丟失。

總RNA提取-柱式提取法

gDNA-Filter Columns 堵塞問(wèn)題

（a）樣品用量太多

本試劑盒適用于提取 10-20 mg 動(dòng)物組織或者 2-5×106 個(gè)細胞，超量的組織會(huì )降低產(chǎn)量以及純度，操作時(shí)應減少樣本使用量。

（b）樣品富含肌纖維

肌肉、心臟以及皮膚等富含肌纖維，肌纖維的分子量大，會(huì )引起柱子堵塞，樣本處理時(shí)采用液氮研磨方式會(huì )降低堵柱現象。

(c) 組織研磨或者勻漿不充分

研磨或者勻漿不充分時(shí)，碎片有可能導致柱堵塞，將裂解后的液體先進(jìn)行 13,000 × g 離心 5 min，取上清再加入 gDNAFilter Columns。

提取不到RNA或者RNA產(chǎn)量低

（a）樣本保存不當或者樣本保存時(shí)間過(guò)久

樣本保存不當或者保存時(shí)間過(guò)長(cháng)都有可能導致 RNA 的降解，采集新鮮樣本或經(jīng)過(guò)液氮速凍后保存于 -70℃或液氮中的樣本。

(b)勻漿或者液氮研磨不充分

勻漿或者液氮研磨不充分，裂解不充分，導致 RNA 的釋放不充分。

(c)洗脫不充分

RNase-free ddH2O 滴加到純化柱膜中央。純化柱的洗脫體積為 50-200 μl，若洗脫效果不理想，可加入提前于 65℃預熱的 RNase-free ddH2O，延長(cháng)室溫放置時(shí)間，離心后進(jìn)行第二次洗脫。

RNA 降解

純化后的 RNA降解與樣本質(zhì)量、是否被 RNase 污染、操作方式等因素有關(guān)：

（a）樣本因為沒(méi)有及時(shí)保存，導致 RNA 降解

組織樣本或者細胞在收集后若不及時(shí)進(jìn)行后續實(shí)驗，液氮速凍后于 -70℃保存。

（b）樣本反復凍融

組織樣本保存時(shí)，分小塊保存，避免因反復凍融導致樣本降解。

（c）電泳原因

RNA 降解現象部分因電泳過(guò)程引起，電泳前將電泳槽用 3％雙氧水浸泡 20 min，之后用 RNase-free ddH2O 進(jìn)行沖洗，電 泳緩沖液用 RNase-free ddH2O 配置。

(d)確保提取過(guò)程中使用的槍頭和離心管均為 RNase-free。

下游實(shí)驗結果不理想

（a）洗脫后 RNA 中有鹽離子殘留

純化柱需要進(jìn)行兩次 Buffer RW2 洗滌，如果兩次洗滌后仍存在鹽離子殘留，則在加入 Buffer RW2 后，室溫放置 5 min 再 進(jìn)行離心操作，以最高水準上去除鹽離子污染。

(b)洗脫后 RNA 有乙醇殘留

確認 Buffer RW2 洗滌后，按操作說(shuō)明所需的離心轉速進(jìn)行空管離心操作；如仍有乙醇殘留，可在空管離心后室溫放置  5 min，最高水準上去除殘留乙醇。

式抽提法

提取的RNA有基因組DNA污染

不同種類(lèi)組織細胞 DNA、RNA 含量相差較大，樣本上樣量請勿超過(guò) 20 mg 組織和 5×106 細胞。如肝臟、脾臟和腎臟 DNA 含量豐富，上樣量請勿超過(guò) 10 mg，否則會(huì )導致基因組殘留過(guò)多。gDNA-Filter Columns 能夠有效去除體系中大部分 DNA，如果下游實(shí)驗對痕量 DNA 敏感，可根據具體情況選擇使用以下方案：

(a) 使用試劑盒提供的 DNase I 工作液進(jìn)行膜上消化清除殘留 DNA，具體過(guò)程請參照實(shí)驗操作流程模塊。

(b)逆轉錄時(shí)選擇含有基因組去除模塊的逆轉錄試劑，推薦使用 HiScript®  III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)  (Vazyme #R323)。

(c)設計引物時(shí)選用跨內含子的引物，從而避免基因組 DNA 模板參與擴增反應。

逆轉錄反應

逆轉錄試劑盒中帶有g(shù)DNA wiper Mix，可以去除殘留在RNA中的基因組。但如果不進(jìn)行基因組去除，會(huì )影響接下來(lái)的逆轉錄嗎？

不去除基因組并不會(huì )影響逆轉錄實(shí)驗的進(jìn)行，但如果基因組殘留嚴重而未進(jìn)行去除，會(huì )影響下游熒光定量實(shí)驗的準確性。

延長(cháng)逆轉錄時(shí)間，是否可以提高逆轉錄效率？

對于一般體系，延長(cháng)逆轉錄時(shí)間對逆轉錄效率并沒(méi)有顯著(zhù)提升；對于一些 GC 含量較高或含高級結構的模板，延長(cháng)逆轉錄 時(shí)間可提升逆轉錄效率。

熒光定量PCR

絕對定量標準曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系不佳

(a)加樣誤差

加大模板稀釋倍數，提高加樣體積。

(b)標準品降解

重新制備標準品，重復實(shí)驗。

(c)模板濃度過(guò)高

增加模板稀釋倍數。

在定量時(shí)，如何判斷cDNA投入量

第一次得到的 cDNA 需要進(jìn)行多個(gè)梯度稀釋?zhuān)瑢⒉煌荻认♂尩?cDNA 進(jìn)行 qPCR 定量，選取 CT 值落在 18-28，或者 15-33 范圍內的擴增曲線(xiàn)對應的 cDNA 稀釋梯度作為后續該基因的參考稀釋度。(CT 值在 18-28，或者 15-33 區間范圍被認為是 準確的 )。

融解曲線(xiàn)多峰

（a）引物設計不優(yōu)：根據設計原則設計合成新的引物。

（b）引物濃度太高：適當降低引物濃度。

（C）cDNA 模板帶有基因組污染：重新制備 cDNA 模板。

（d）CT 值≥ 30 易出現非特異擴增。

陰性對照出現明顯擴增

(a)反應體系污染

更換新的 Mix、水、引物重復實(shí)驗。反應體系在超凈工作臺內配制，減少氣溶膠污染。

(b)擴增為引物二聚體引起

配合融解曲線(xiàn)進(jìn)行分析。

CT值出現太晚

(a)擴增效率極低

優(yōu)化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計合成引物。

（b）模板濃度太低

減少稀釋度重復實(shí)驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

(c)模板降解

重新制備模板，重復實(shí)驗。

(d)PCR 產(chǎn)物太長(cháng)

推薦 PCR 產(chǎn)物長(cháng)度為 80 bp-150 bp。

（e）體系中存在 PCR 抑制劑

重新制備模板，重復實(shí)驗。

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熒光定量 PCR

熒光定量 PCR

逆轉錄反應

總 RNA 提取 - 酚氯仿抽提法

總 RNA 提取 - 酚氯仿抽提法

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