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      小鼠肝細胞培養實(shí)驗

      發(fā)布時(shí)間: 2023-01-05  點(diǎn)擊次數: 1230次

      原理

      直接從生物體內獲取組織細胞進(jìn)行的首-次培養稱(chēng)為原代細胞培養。原代培養是建立各種細胞系的第一步,是從事培養工作的人員應熟悉和掌握的最基本的技術(shù)。根據培養方法不同分為組織塊培養法和單層細胞培養法。

      材料與儀器

      小鼠
      DMEM DMEM 胰酶 PBS
      飯盒 紗布 小剪子 小鑷子 大鑷子 大燒杯 平皿 研磨玻片 濾網(wǎng) 離心管 6 孔培養板 吸管 移液管 手套 微量加樣器

      步驟

      一、實(shí)驗步驟

      1. 將小鼠斷頸致死,置 75%酒精泡2-3 秒鐘,取肝臟,置于盛有 PBS 的平皿中。
       
      2. 剔除脂肪、結締組織、血液等雜物,轉移到另一個(gè)盛有 PBS 液的平皿中。
       
      3. 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊(大小約 1mm2),玻片研磨,轉到離心管,離心(1000 rpm,5 min)。
       
      4. 視組織或細胞量加額加入5-6 倍(3-5  ml)胰酶,37℃中消化 20 分鐘,每隔 5 分鐘振蕩一次,或用吸 管吹打一次,使細胞分離。
       
      5. 加入3-5 ml 含血清的培養液以中止胰酶消化作用。
       
      6. 用100 目孔徑濾網(wǎng)濾過(guò),除去未消化的大組織塊。
       
      7. 再次離心5 min,棄上清液。
       
      8. 加入無(wú)血清培養液5 ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
       
      9. 加入含血清的培養液 1-2 ml (視細胞量),血球計數板計數。
       
      10. 將細胞調整到5x105/ml 左右,轉移至6 孔培養板中,37℃下培養。
       

      注意事項

      1. 自取材開(kāi)始,保持所有組織細胞處于無(wú)菌條件。細胞計數可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。

       

      2. 在超凈臺中,組織細胞、培養液等不能暴露過(guò)久,以免溶液蒸發(fā)。

       

      3. 凡在超凈臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住,以防止細菌落入。

       

      4. 操作前要洗手,進(jìn)入超凈工作臺后要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。

       

      5. 點(diǎn)燃酒精燈,操作在火焰附近進(jìn)行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(cháng),以免退火,且冷卻后才能夾取組織。吸取過(guò)營(yíng)養液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。

       

      6. 操作動(dòng)作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動(dòng),增加污染機會(huì )。

       

      7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分,工作臺面上的用品擺放要布局合理。

       

      8. 瓶子開(kāi)口后要盡量保持45°斜位。

       

      9. 吸溶液的吸管等不能混用。


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