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      原代細胞怎么永生化

      發(fā)布時(shí)間: 2023-01-04  點(diǎn)擊次數: 1094次

      原代細胞都無(wú)法擴增幾輪增殖,這被稱(chēng)為Hayflick極限,因為每一輪的增殖都會(huì )縮短端粒。當端粒達到臨界縮短長(cháng)度時(shí),DNA損傷被觸發(fā),導致細胞衰老,如果你試圖培養一個(gè)珍-稀原代細胞群,當心它最終會(huì )死亡,可以對細胞進(jìn)行操縱,以繞過(guò)衰老過(guò)程并變得不朽,原代細胞永生化就是有這么神奇的事情。

       

      自發(fā)性永生化細胞最-好-的例子就是癌細胞,它們可能經(jīng)歷了抵抗衰老的基因變化,并且開(kāi)始“長(cháng)生不老"。其實(shí)許多癌細胞株也沒(méi)有這種變化,事實(shí)上,喬治·蓋伊(George Gey)這位科學(xué)家創(chuàng )造了第一個(gè)永生的、可以說(shuō)是最著(zhù)名的細胞株:HeLa細胞,他在偶然發(fā)現亨麗埃塔(Henrietta)手術(shù)后的腫瘤內有高度化生長(cháng)子宮癌細胞,在此之前,他測試了數百個(gè)癌細胞以獲得永生的方法,但是都失敗了。

      圖片1.png 

      許多病毒基因影響細胞周期,因此可以通過(guò)消除增殖控制的生物剎車(chē)來(lái)克服衰老。其中許多是腫瘤抑制基因,因為它們需要抑制腫瘤的發(fā)生。其中最常見(jiàn)的是猿病毒大T抗原(SV-40)的過(guò)度表達,它抑制細胞的Rb基因和p53基因,這兩種基因都是細胞生長(cháng)周期的關(guān)鍵控制器。SV40永生化的細胞系著(zhù)名的例子是HEK293T,也稱(chēng)為293T細胞,這是一種廣泛用于表達病毒顆粒和細胞分析的細胞系,因為它們很容易轉染。其他病毒基因包括來(lái)自人乳頭瘤病毒(HPV)的基因,如E6和E7,它們也以Rb和p53基因為靶點(diǎn),比如人支氣管上皮細胞HBE-E6E7等。

       

      最著(zhù)名的不朽基因是端粒酶(hTERT)。端粒酶是一種核糖核蛋白,能夠延長(cháng)端粒的DNA序列,從而減緩衰老過(guò)程,使細胞經(jīng)歷無(wú)限的細胞分裂。事實(shí)上,端粒酶最近被認為是一種逆轉衰老的潛在機制。使用端粒酶逆轉衰老的問(wèn)題在于,端粒酶表達增加也會(huì )誘導腫瘤生長(cháng)。事實(shí)上,許多用于創(chuàng )造永生化細胞系的基因,如hTERT和SV40,都會(huì )誘導腫瘤形成。因此,毫不奇怪的是,hTERT經(jīng)常在人類(lèi)腫瘤中過(guò)度表達,從而賦予癌癥的一個(gè)關(guān)鍵特征:不受限制的增殖。這正是我們在使原代細胞系永生化時(shí)使用它的目的!

       

      在某些類(lèi)型的細胞中,僅使用一種永生化方法可能會(huì )產(chǎn)生少量永生細胞。因此,根據您的細胞系,將腫瘤抑制因子(如上述細胞周期抑制劑)的抑制和hTERT的表達結合起來(lái)以增加更多的細胞永生化的可能。如果你想使你的細胞系永生化和轉化(即使其像致瘤細胞一樣),也建議使用這種雙重方法,因為有證據表明,如果沒(méi)有永生化,一些細胞系就不能進(jìn)行有效的轉化。

       

      如何將永生引入原代細胞系

      以上許多不朽的來(lái)源都是基于對原代細胞的基因操作。這需要將外源DNA導入細胞。由于許多原代細胞難以轉染,因此將基因改變引入原代細胞的最-簡(jiǎn)-單和最-有效的方法是通過(guò)病毒感染。

       

      最-流-行的方法是通過(guò)復制缺陷慢病毒,因為它們比腺病毒安全,腺病毒具有重新感染細胞的能力,因此含有活病毒的時(shí)間更長(cháng)。逆轉錄病毒也可用于轉染細胞,然而,它們只能感染活躍分裂的細胞,從而減少可能被病毒轉導的細胞數量。

       

       

      警告:原代細胞不朽可能不是最-好-的途徑!

       

      通過(guò)將基因改變引入細胞,你可能正在深刻地改變細胞系的表型。雖然這確實(shí)使你的細胞系在某些方面更有用:它可能使你的細胞更同質(zhì),從而可以輕松復制結果,你可以創(chuàng )建大量細胞供將來(lái)使用,并且它們可能更容易實(shí)驗,但使用原代細胞系仍然有許多好處,原代細胞可以保持正常細胞的新陳代謝,可以維持正常細胞的生理特征,并且具有實(shí)驗的統一性和重復性,但隨著(zhù)原代細胞的永生轉染,細胞群體和細胞機制發(fā)生改變,這可能會(huì )混淆您的實(shí)驗,并導致不確定或錯誤的結果。此外,關(guān)于永生化細胞如何準確地模擬真實(shí)組織還有很多爭論。

       

      盡管存在爭議,但SV40不太可能感染人類(lèi),盡管SV40的作用機制:p53和Rb突變可能是人類(lèi)腫瘤中非常常見(jiàn)的突變。因此,重要的是要確定最佳的基因操作來(lái)使用永生你的細胞類(lèi)型。

       

      盡管永生化細胞在實(shí)驗研究中的效用非常強大,但在使用中必須接受一些警告。與任何實(shí)驗模型一樣,永生化細胞只是您預期細胞系統的模型。


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