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從骨骼肌分離和培養單肌纖維的方法步驟

發(fā)布時(shí)間： 2021-11-15　　點(diǎn)擊次數： 2203次

材料與儀器
Matrigel DMEM L-谷氨酰胺 Ⅰ型膠原蛋白
青霉素和鏈霉素混合液雞胚提取液馬血清胎牛血清接種培養液增殖培養液
Petri培養皿改良Pasteur吸管 24孔培養板鉆石筆透照立體解剖顯微鏡
步驟
1. 處死動(dòng)物后立即切除肌肉。注意夾持肌腱，以減少對肌纖維的損傷。

2. 將肌肉放入 0.2 % Ⅰ型膠原蛋白酶液（W / V，用 DMEM 配制），在 35°C 條件下用搖動(dòng)水浴箱孵育 60~90 min。較大肌肉需要較長(cháng)消化時(shí)間，一般情況下取自 6~8 周大鼠的趾長(cháng)伸肌需消化 60 min 。

3. 準備盛肌纖維的 Petri 培養皿，即用馬血清浸洗培養皿，以免肌纖維黏附于培養皿底壁上。然后，加入 20 ml DMEM。

4. 消化后將肌肉移入盛有 DMEM 的 Petri 培養皿。

5. 在透照立體解剖顯微鏡下，用改良 Pasteur 吸管（將 Pasteur 吸管割斷，用鉆石筆將開(kāi)口弄大。然后，用火使鋸齒狀邊緣變光滑，以免損傷肌纖維）研磨肌肉，使單肌纖維分散。

用 10 % 馬血清（用 DMEM 配制）浸蘸吸管，以免肌纖維黏附吸管。

6. 肌纖維被分散時(shí)，肌肉的直徑變小。逐漸用口徑小的 Pasteur 吸管。

7. 當分離 20~30 條肌纖維時(shí)，將肌肉移入另一 Petri 培養皿，繼續分離，直至分離得到足夠的肌纖維。

8. 較大肌肉需要第二次消化，以分散位于中央處的肌纖維。表淺的肌纖維被分離后，將剩余的肌肉放人膠原蛋白酶液，進(jìn)一步消化。

9. 將肌纖維放入涂有 Matrigel （1 mg/ml，用 DMEM 配制）的培養皿。

(a)將單肌纖維放于培養皿中央，讓其貼于 Matrigel。為了培養純單肌纖維，只放入未損傷的肌纖維，除去較皺縮部分。這些部分可能有污染的附著(zhù)細胞，多為微血管段；

(b)慢慢加入接種培養液（DMEM，添加 10% 馬血清、0.5% 雞胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素），注意勿移動(dòng)接種的肌纖維。

10. 將培養皿放入培養箱，在 37°C 和 5 % CO2 條件下培養。

增殖

培養 12~24 h 后，衛星細胞開(kāi)始從肌纖維遷出。至 3~4 天，每條肌纖維周?chē)?50~300 個(gè)衛星細胞。確切細胞數取決于肌纖維來(lái)源的肌肉和小鼠周齡等多種因素 [ Bockhold et al.，1998 ] 。

11. 許多衛星細胞從肌纖維遷出時(shí)，用 Pasteur 吸管將肌纖維吸出。應在火焰上將吸管尖部拉細。

12. 繼續培養剩余的細胞。

13. 如果需要，可傳代培養，用增殖培養液（DMEM，添加 20% FBS、10% 馬血清、1% 雞胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）接種細胞。

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